脂氧素受体激动剂对巨细胞病毒复制增殖的影响

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.001

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (29): 4593-4598.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.29.001

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脂氧素受体激动剂对巨细胞病毒复制增殖的影响

陈晓红^1，2，舒赛男¹，刘兴楼¹，王慧¹，张菊¹，杜小弋^1，2，李革¹，方峰¹

¹华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科系，湖北省武汉市 430030；²武汉市儿童医院，湖北省武汉市 430016

修回日期:2014-05-26 出版日期:2014-07-09 发布日期:2014-07-09
通讯作者: 方峰，博士，教授，华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科系，湖北省武汉市 430030
作者简介:陈晓红，女，1971年生，湖北省黄梅县人，汉族，华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科在读博士，湖北省武汉市儿童医院副主任医师，主要从事儿科感染方面的研究。
基金资助:
高等学校博士学科点专项科研基金(20090142110076)

Effect of lipoxin receptor agonist on human cytomegalovirus replication and proliferation

Chen Xiao-hong^{1, 2}, Shu Sai-nan¹, Liu Xing-lou¹, Wang Hui¹, Zhang Ju¹, Du Xiao-yi^{1, 2}, Li Ge¹, Fang Feng¹

¹Department of Pediatrics, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China; ²Wuhan Children’s Hospital, Wuhan 430016, Hubei Province, China

Revised:2014-05-26 Online:2014-07-09 Published:2014-07-09
Contact: Fang Feng, M.D., Professor, Department of Pediatrics, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China
About author:Chen Xiao-hong, Studying for doctorate, Associate chief physician, Department of Pediatrics, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science & Technology, Wuhan 430030, Hubei Province, China; Wuhan Children’s Hospital, Wuhan 430016, Hubei Province, China
Supported by:
Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education, No. 20090142110076

摘要/Abstract

摘要：

背景：脂氧素的抗炎及保护效应已经在多种免疫相关疾病模型中被验证，课题组前期研究结果亦显示，脂氧素受体激动剂BML-111对巨细胞病毒诱导的免疫损伤有负调节作用，那么，它对病毒的复制将产生怎样的影响呢？

目的：观察脂氧素受体激动剂BML-111对人巨细胞病毒在THP-1源巨噬细胞及人胚肺成纤维细胞中复制增殖的影响。

方法：用HCMV AD169毒株感染THP-1源巨噬细胞(MOI=0.5)，设立模拟感染组、人巨细胞病毒感染组及人巨细胞病毒+BML-111组，BML-111的终浓度为100 nmol/L；于感染后0，1，2，4，12，24，36，48 h收集各组细胞，用RT-PCR法检测细胞中IE86和pp65 mRNA的水平；人巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞(MOI=0.1)，设立人巨细胞病毒感染组与人巨细胞病毒+BML-111组，逐日光镜观察人胚肺成纤维细胞病变并计数其比率；蚀斑法测定人胚肺成纤维细胞内感染性人巨细胞病毒滴度。

结果与结论：人巨细胞病毒感染巨噬细胞后，与模拟感染组相比，人巨细胞病毒感染组和人巨细胞病毒+ BML-111组IE86 mRNA及pp65 mRNA表达明显升高；与人巨细胞病毒感染组相比，人巨细胞病毒+BML-111组IE86 mRNA及pp65 mRNA在细胞感染早期(4 h内)表达明显升高，但在感染中晚期 (24-72 h)，pp65 mRNA的表达明显降低。人巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞后，与人巨细胞病毒感染组相比，人巨细胞病毒+BML-111组细胞提前2 d达到100%细胞病变；感染性病毒滴度提前2 d达到峰值，但两组病毒滴度峰值差异无显著性意义。结果显示BML-111在感染早期加快人巨细胞病毒在细胞内的复制速度，在感染晚期抑制pp65基因表达；BML-111在体外对人巨细胞病毒的感染性病毒增殖量无影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 组织工程, 巨细胞病毒, 巨噬细胞, 胚肺成纤维细胞, 脂氧素, 病毒复制

Abstract:

BACKGROUND: The anti-inflammation and protective effects of lipoxin have been verified in several immunity-related disease models. Preliminary studies of our research group have shown that, lipoxin receptor agonist BML-111 has negative regulation effects on the human cytomegalovirus (HCMV)-induced immunological injury. However, the effect of BML-111 on the HCMV replication remains unclear.

OBJECTIVE: To observe the influence of lipoxin receptor agonist BML-111 on HCMV replication and proliferation in THP-1 macrophages and human embryonic lung fibroblasts.

METHODS: THP-1 macrophages were infected by HCMV AD169 strain, and were divided into three groups: mock infection, HCMV infection, HCMV+BML-111. The final concentration of BML-111 was 100 nmol/L. Cells in each group were collected at 0, 1, 2, 4, 12, 36, 48 hours, the mRNA levels of IE86 and pp65 in the THP-1 macrophages were tested by RT-PCR method. Human embryonic lung fibroblasts were infected with HCMV (MOI=0.1), and were divided into two groups: HCMV infection and HCMV+BML-111. The patho-morphous changes of human embryonic lung fibroblasts were observed under light microscope, and the cell number was measured. The infective virus titer changes in human embryonic lung fibroblasts were examined by plaque assay.

RESULTS AND CONCLUSION: After the macrophages were infected by HCMV, compared with the mock infection group, the mRNA levels of IE86 and pp65 in the HCMV group and HCMV+BML-111 group were increased significantly; compared with the HCMV infection group, the mRNA levels of IE86 and pp65 in the HCMV+BML-111 group were increased significantly in the early stage (within 4 hours) after infection, but the pp65 mRNA levels were decreased significantly in the medium and late stages (24-72 hours) after infection. After human embryonic lung fibroblasts were infected by HCMV, the degree of the patho-morphous in the HCMV+BML-111 group reached 100% 2 days earlier than the of HCMV infection group. The infective virus titer reached the peak 2 days earlier than the HCMV infection group, but no significant difference was found between the two groups. BML-111 accelerates the replication of HCMV in the early stage of infection, but inhibits the expression of pp65 gene in the late stage. BML-111 has no impact on the proliferation of the infective HCMV titer in vitro.

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Key words: cytomegalovirus, cytomegalovirus infections, macrophages, lipoxins, virus replication

中图分类号:

R318

陈晓红，舒赛男，刘兴楼，王慧，张菊，杜小弋，李革，方峰. 脂氧素受体激动剂对巨细胞病毒复制增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(29): 4593-4598.

Chen Xiao-hong, Shu Sai-nan, Liu Xing-lou, Wang Hui, Zhang Ju, Du Xiao-yi, Li Ge, Fang Feng . Effect of lipoxin receptor agonist on human cytomegalovirus replication and proliferation[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(29): 4593-4598.

图/表（结果） 1

2.1 BML-111对人巨细胞病毒在人THP-1源巨噬细胞中复制的影响 与模拟感染组相比，人巨细胞病毒感染组和人巨细胞病毒+BML-111组IE86及pp65 mRNA表达明显升高(P < 0.05)。其中，人巨细胞病毒感染组和人巨细胞病毒+BML-111组IE86 mRNA均在0 h时即显著升高，人巨细胞病毒组1 h达高峰，人巨细胞病毒+BML-111组2 h达高峰，均在4 h后迅速下降。人巨细胞病毒感染组和人巨细胞病毒+BML-111组pp65 mRNA亦均在0 h显著升高，人巨细胞病毒感染组在36 h达高峰，48 h之后缓慢下降，人巨细胞病毒+BML-111组在1 h即达高峰，4 h后迅速下降。与人巨细胞病毒感染组相比，人巨细胞病毒+BML-111组IE86 mRNA高峰延迟，pp65 mRNA高峰提前，两者峰值均升高(P < 0.05)，见图1，2。

2.2 BML-111对人巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞后致细胞病变的影响 人巨细胞病毒感染后，人胚肺成纤维细胞逐渐发生细胞病变效应，具有特征性表现：开始出现细胞肿胀，并且变大、变圆，在感染早期，病变细胞零星分布，或几个相连；在感染晚期，病变细胞则呈葡萄串样，可以见到多核巨细胞，最后病变细胞坏死、脱落。

倒置显微镜下每日观察巨细胞病毒感染后人胚肺成纤维细胞病变程度，可见：第3天，人巨细胞病毒感染组尚未出现细胞病变，而人巨细胞病毒+BML-111组出现5%细胞病变；第5天，人巨细胞病毒感染组出现20%细胞病变，而人巨细胞病毒+BML-111组出现40%细胞病变；第8天，人巨细胞病毒感染组出现65%细胞病变，而人巨细胞病毒+BML-111组出现100%细胞病变，并脱落。与人巨细胞病毒感染组相比，人巨细胞病毒+BML-111组细胞先出现病变(P < 0.05)，并先达到100%病变(P < 0.05)，见图3。
2.3 BML-111对人巨细胞病毒在人胚肺成纤维细胞内感染性病毒滴度的影响用蚀斑法测定人胚肺成纤维细胞内感染性人巨细胞病毒滴度，受人巨细胞病毒感染后，两组细胞内扩增的感染性病毒滴度逐日升高，人巨细胞病毒组在第9天达到峰值，平均滴度为1.13×10⁷PFU，而人巨细胞病毒+BML-111组在第7天达到峰值，平均滴度为0.87×10⁷ PFU。与人巨细胞病毒组相比，人巨细胞病毒+ BML-111组的病毒滴度先达到峰值(P < 0.05)，但两组病毒滴度峰值差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4。

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引言

材料方法

设计：细胞免疫学实验。

时间及地点：实验于2010年1至7月在华中科技大学附属同济医院儿科病毒实验室完成。

材料：人单核细胞白血病THP-1细胞购自中国典型培养物保存中心(武汉)。HCMV AD169病毒株由中国预防医学科学院病毒研究所提供，在华中科技大学附属同济医院儿科病毒实验室传代适应。

脂氧素受体激动剂BML-111购自Enzolifescience公司，根据预实验结果，设定BML-111的实验终浓度为 100 nmol/L；佛波酯(PMA)购自晶美生物有限公司。PCR引物由上海吉玛制药技术有限公司合成。Trizol购于Invitrogen公司。SYBRgreen Real-time PCR试剂盒购于TaKaRa公司。

病毒感染性滴度测定采用标准蚀斑法。感染复数(MOI)=病毒蚀斑形成单位(PFU)/细胞计数。

实验方法：

细胞培养：THP-1细胞在含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、0.1 g/L链霉素的RPMI 1640培养液中，于37 ℃、体积分数为5% CO₂条件下培养，按1×10⁹ L^-¹转入6孔培养板中，加入终浓度为100 nmol/L的佛波酯诱导使其分化为巨噬细胞。培养24 h后，细胞用无血清的1640培养液洗3次。

巨噬细胞实验分组：将THP-1源巨噬细胞分成3组(每组各3孔)：①人巨细胞病毒感染组：用MOI=0.5的人巨细胞病毒感染THP-1源巨噬细胞1 h后，更换维持液(含体积分数为4%胎牛血清的RPMI 1640培养液)，并每24 h更换维持液。②模拟感染组：用与病毒液等体积的1640培养液处理THP-1源巨噬细胞1 h后，更换维持液，并每24 h更换维持液。③人巨细胞病毒感染+BML-111处理组：MOI=0.5的人巨细胞病毒感染THP-1源巨噬细胞1 h后，更换含 100 nmol/L BML-111的维持液，并每24 h更换含 100 nmol/L BML-111的维持液。

人胚肺成纤维细胞实验分组：将人胚肺成纤维细胞分成2组(每组各3孔)：①人巨细胞病毒感染组：用MOI=0.1的人巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞1 h后，更换维持液，并每24 h更换维持液。②人巨细胞病毒+BML-111组：MOI=0.1的人巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞1 h后，更换含100 nmol/L BML-111的维持液，并每24 h更换含 100 nmol/L BML-111的维持液。

病毒感染巨噬细胞：接种适量HCMV AD169病毒悬液于THP-1源巨噬细胞，使MOI=0.5。以病毒吸附(37 ℃， 1 h)后更换维持液的完成时间为计时起点(0 h)，设实验检测时间点为1，2，4，8，12，24，36，48 h，收集各时间点细胞样本及上清液，-70 ℃保存备用。

病毒感染人胚肺成纤维细胞：接种适量HCMV AD169病毒悬液于人胚肺成纤维细胞，使MOI=0.1。以病毒吸附 (37 ℃，1 h)后更换维持液的完成时间为计时起点(0 d)，设实验检测时间点为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 d，各时间点观察细胞病变，并收集病毒悬液，-70 ℃保存备用。

Real-time RT-PCR法检HCMV IE86及pp65 mRNA表达：采用SYBR green real-time RT-PCR法检测HCMV IE86及pp65 mRNA的表达。Trizol提取细胞总RNA，检测RNA纯度在1.72-1.85之间；取2 μg RNA合成cDNA第1链，每份样本同时定量检测目的基因和内参GAPDH基因，各设3个复管。

各引物序列和扩增片段长度如下：IE86 (172 bp)：上游引物 5’-GTG CGG CAT AGA ATC AAG GA-3’，下游引物 5’-TGC TCT GCA TAG TTA GCC CAA T-3’；PP65 (224 bp)：上游引物5’-CGT CAG CGT TCG TGT TTC C-3’，下游引物5’-GGT CAT CGT TAG GTC CTC TTC C-3’；GAPDH (96 bp)上游引物5’-GCA CAG TCA AGG CCG AGA A-3’，下游引物5’-CCT CAC CCC ATT TGA TGT TAG TG-3’。

反应体系：SYBR premix Ex Taq 12.5 μL、forward primer (10 μmol/L) 0.5 μL、reverse primer (10 μmol/L) 0.5 μL、rox reference dye Ⅱ 0.5 μL和样本cDNA 1 μL，总体积25 μL。反应条件：95 ℃预变性10 s，1个循环；95 ℃ 5 s，58 ℃ 20 s，共45个循环。

Real-time PCR目的基因的标准曲线显示，目的基因和内参基因扩增效率相似，故能够应用2^-^ΔΔCt法进行处理^[16]。计算各标本平均Ct值和ΔCt值，根据公式ΔCt，Timex=(Ct, Target-Ct, GAPDH) Timex，ΔΔCT=(ΔCt, Timex-ΔCt, Calibrator)，Timex为实验各时点，ΔCT，calibrator为模拟感染组中0 h的ΔCt值，计算2^-^ΔΔCt数值用于表示目的基因相对于参照值的倍比率。

观察人巨细胞病毒感染后人胚肺成纤维细胞病变：每日在倒置显微镜下观察细胞病变，记录每孔病变细胞百分比。

蚀斑法测定感染性人巨细胞病毒滴度：采用标准蚀斑形成实验，取0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10 d各时间点收集的病毒悬液分别连续10倍递减稀释，稀释梯度为10^-¹-10^-⁶；取各稀释浓度病毒液300 μL接种于24孔培养板内单层的人胚肺成纤维细胞上，每种梯度4个复孔，吸附1 h后，弃去培养孔中液体，换含1%甲基纤维素覆盖，至 37 ℃，体积分数为5% CO₂培养箱培养；5-7 d后，以体积分数为10%甲醛固定30 min，流水冲去每孔中的纤维素凝块；用0.5%结晶紫染色5 min，水洗；倒置显微镜下观察计数各孔蚀斑数，共重复3次。根据公式计算各组上清中感染性病毒量。感染性病毒量(PFU/mL)=蚀斑均数×病毒稀释倍数/病毒接种量(mL)。

主要观察指标：受人巨细胞病毒感染的巨噬细胞中IE86mRNA及pp65 mRNA的水平、受人巨细胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞病变程度及病毒滴度。

统计学分析：所有数据用SPSS 13.0软件分析，以x(_)±s表示，组间比较采用单因素方差分析及t 检验进行比较， P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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讨论

人巨细胞病毒基因在宿主细胞内的转录表达呈现一定的时序性，可分为即刻早期(immediately early, IE)、早期(early, E)和晚期(late, L)^[17-20]。IE86与pp65蛋白分别由即刻早期基因及晚期基因编码。即刻早期基因表达一般发生在病毒感染后1 h内，几乎在病毒完成传入后立即开始表达，其mRNA在病毒感染后2 h即可检测到。早期基因的表达一般开始于病毒感染后2-4 h。即刻早期基因和早期基因及其蛋白质调控人巨细胞病毒晚期基因的转录和翻译^[21]。晚期基因的表达一般在病毒感染后36-48 h开始。晚期蛋白质是人巨细胞病毒装配的结构成分，其中包括病毒衣壳、被膜和包膜蛋白等^[22-24]。

脂氧素有免疫负调节作用，有文献报道，弓形虫感染大鼠可诱导产生脂氧素，抑制脾脏树突状细胞向淋巴结迁移及白细胞介素12表达；而在脂氧素合成酶缺陷鼠(不能合成内生脂氧素)中，白细胞介素12、肿瘤坏死因子α和γ-干扰素水平显著上升，减少了脑内包囊，出现更高的肿瘤坏死因子α和诱导型一氧化氮合酶在中枢神经系统细胞内浸润，导致更高的死亡率^[12]。可见脂氧素防止免疫应答的过度活化而造成的自身组织损伤，可能是宿主所表现的自我防御机制。

本实验室前期数据提示，脂氧素受体激动剂BML-111对巨细胞病毒引起的免疫损伤有负调节作用，那么，它对病毒的复制将产生怎样的影响呢？在本部分研究中，作者建立了人巨细胞病毒感染巨噬细胞模型及人巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞模型，分别检测病毒基因及感染性病毒滴度，以观察BML-111对巨细胞病毒复制的影响。结果显示，人巨细胞病毒感染后，IE86 mRNA高峰在感染早期表达，pp65 mRNA高峰在感染的中晚期表达，与既往的文献报道相一致。而在BML-111处理过的细胞中人巨细胞病毒基因表达的时序性发生了改变，IE86 mRNA高峰延迟，pp65 mRNA高峰提前，后者尤其明显。pp65是人巨细胞病毒的被膜蛋白，在病毒与包膜融合后很快被运送至细胞核，它的功能十分复杂，目前尚不完全清楚。BML-111为何使pp65 mRNA高峰显著提前，甚至提前到IE86mRNA高峰之前，是一个非常有趣的现象，可能会导致病毒增殖更快、细胞病变更早出现，其机制尚待进一步探索。

另一方面，予MOI=0.1的人巨细胞病毒感染人胚肺成纤维细胞后，光镜下每日观察人胚肺成纤维细胞病变程度，可见第4天开始出现10%细胞病变，第9天出现85%细胞病变，第10天出现100%病变，并脱落。而加用BML-111处理感染细胞后，第3天即出现5%细胞病变，第7天出现80%细胞病变，第8天出现100%病变，并脱落，细胞病变比率曲线左移，提示BML-111可加速病毒复制。蚀斑法测定人胚肺成纤维细胞内扩增的感染性人巨细胞病毒滴度，可见BML-111处理感染细胞后，病毒滴度先达到峰值，但两组病毒滴度峰值无差异。BML-111使人巨细胞病毒增殖更快、细胞病变更早出现，考虑与pp65 mRNA高峰提前有关；但两组病毒滴度峰值相同，提示BML-111并未增加细胞的病毒载量。

巨细胞病毒感染宿主细胞，需要宿主细胞保持存活以利其传播^[25-27]。细胞在进化的过程中已经产生许多自杀途径，其中大部分是在病毒感染过程中，由病毒本身、或者由免疫效应细胞发出的信号激活。因为细胞死亡可以削弱病毒复制，病毒不得不拿出适当的对策以抑制细胞死亡，这尤其体现在大而复制慢的巨细胞病毒中，因此病毒更愿意编码细胞死亡抑制剂，而不是让其在确定的日期死亡^[28-30]。这些特点在细胞自稳以及宿主防御方面给研究者提供了新的见解，也许还可以针对感染过程中选择性地激活受感染细胞死亡提供新的药物治疗标靶。因此，宿主需要寻找针对巨细胞病毒感染的免疫平衡，既要尽量维持抗病毒免疫应答，降低体内病毒数量，又要控制免疫应答的强度，以避免造成宿主自身的损伤。抗病毒免疫应答过强可能引发自身免疫性疾病，抗病毒免疫应答不足可能造成病毒在体内持续存在或扩散。实验显示，脂氧素可以改变巨细胞病毒基因表达的时序性，加速受感染细胞死亡，不增加细胞的病毒载量。同时脂氧素在巨细胞感染过程中发挥免疫负调节作用，减少机体的免疫损伤。脂氧素是否可以为治疗巨细胞病毒感染提供一个新的选择，有待进一步去深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

全文链接：

脂氧素受体激动剂对巨细胞病毒复制增殖的影响

Effect of lipoxin receptor agonist on human cytomegalovirus replication and proliferation

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